摘要： 目的：设计靶向人端粒酶反转录酶的RNAi序列，构建shRNA表达载体质粒和hTERT真核表达质粒，采用共转染工具细胞筛选出有效靶点。方法：首先以EASYTMsiRNA软件针对hTERT设计5个靶点siRNA序列和1条通用阴性对照序列，合成shRNA oligo表达框架，将其分别连接至经酶切消化的载体质粒、pGCsi-U6/Neo/GFP、pGCL-GFP，重组质粒转化DH5α，阳性克隆进行PCR与测序鉴定；然后从cDNA文库中利用PCR钓取hTERT基因片段，与表达载体pEGFP-C1分别进行双酶切、纯化及定向连接、重组、转化，阳性克隆行PCR与测序鉴定，荧光镜检GFP表达；最后上述2个质粒系统共转染293T细胞，Western印迹检测hTERT蛋白表达水平，筛选最有效序列。应用SPSS16.0软件包对所得数据进行单因素方差分析。结果：BLAST检索5条hTERT siRNA序列均能100%命中，且不与其他基因同源；PCR鉴定及阳性克隆测序验证shRNA oligo与载体质粒成功连接、重组。hTERT基因PCR钓取片段产物大小1.4 Kp，经酶切与质粒连接，形成pEGFP-C1-hTERT表达载体，阳性克隆PCR、测序鉴定确定成功重组；转染293T细胞48h时荧光镜下可观察到GFP标记的hTERT融合蛋白。hTERT表达质粒和shRNA载体质粒共转染293T细胞，48h时Western印迹检测结果显示：实验各组hTERT蛋白量均有不同程度减少，而内参对照β-actin和GAPDH无明显变化。经β-actin校正，得到各组hTERT蛋白相对表达量：KD No.1-5实验组与NC组相比，hTERT基因表达均得到不同程度的敲减（54.61％～76.84％，P<0.05），其中No.4敲减效能最高。结论：5条RNAi设计序列均可有效、特异性地沉默hTERT基因的转录和表达水平，其中以5’-GCAAGTTGCAAAGCATTGGAA-3’敲减效能最优；构建外源基因的过表达载体质粒转染工具细胞，可作为RNAi敲减效率筛选的验绩标靶。